产品货号：
SNM064
中文名称：
超微量ATP酶测试盒(Na+K+、Ca2+Mg2+－ATP酶)
英文名称：
Minim ATP enzyme test kit(Na + K +, Ca2 + Mg2 +-ATP enzyme)
产品规格：
75管/25样|150管/50样
发货周期：
1～3天
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ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。
ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上，是生物膜上的一种蛋白酶，它在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用，机体在缺氧及一些疾病状态下，此酶活力发生一系列改变，另外有些遗传疾病也与此酶活力有关。
- 快速简便：全程约50分钟，可测100例左右样本。
- 取样量微：本法取样本量100μL。
- 稳定性好：试剂盒2～8℃存放6个月有效。
- 再现性好：变异系数CV=1.7%。
- 回收试验：X =103.3%。
- 受外界影响因素小：干扰因素少，重复性强。
- 测试面广：可测动物组织、红细胞以及各种培养细胞、各种水产等，效果均佳。
| 组分 | 75管/25样 | 150管/50样 | 保存 |
| 试剂一 | 20mL | 2×20mL | 4℃ |
| 试剂二 | 2×4mL | 4×4mL | 4℃ |
| 试剂三粉剂 | 6支 | 12支 | －20℃ |
| 试剂四 | 2×5mL | 4×5mL | 4℃ |
| 试剂五甲液 | 6×7mL | 12×7mL | 4℃ |
| 试剂五乙液 | 6×6mL | 12×6mL | 4℃避光 |
| 试剂六 | 80mL | 2×80mL | 室温 |
| 试剂七：10mmol/L标准磷贮备液 | 5mL | 5mL | 4℃ |
| 试剂八 | 2×4mL | 3×4mL | 4℃ |
| 试剂九粉剂 | 4支 | 8支 | 4℃ |
| 试剂九稀释液 | 4×0.5mL | 8×0.5mL | 4℃ |
| 试剂十贮备液 | 3×0.1mL | 6×0.1mL | 4℃ |
| 试剂十稀释液 | 3×0.9mL | 6×0.9mL | 4℃ |
| 双蒸水 | 60mL | 60mL | 4℃ |
- 试剂三：用时每支试剂三粉剂加双蒸水1mL，充分溶解。用不完－20℃以下可保存一周。
- 试剂九：用时取一支试剂九稀释液加入一支试剂九粉剂中，充分混匀，用不完的4℃保存。
- 试剂十：用时取一支试剂十稀释液加入一支试剂十储备液中，完全溶解，用不完的4℃保存。
- 0.1μmol/mL标准磷应用液：用时将10mmol/L磷贮备液100倍稀释，即取0.1mL加双蒸水至10mL。
- 0.02μmol/mL磷标准液：用时将0.1μmol/mL磷标准液用双蒸水5倍稀释，即取0.1μmol/mL磷标准液1mL加双蒸水4mL。
- 基质液：按试剂一︰试剂二︰试剂三＝ 260︰80︰80比例混合。需多少配多少，现用现配。
- 显色剂：用时取一瓶试剂五甲液加入一瓶已预温好试剂五乙液中，充分混匀，需提前0.5小时配制，2～8℃条件下至少可保存5天，配好的显色剂的量够做13个管子(如果你的样本量很少，所需的显色剂的量较少，那么你可以按试剂五中的甲液︰乙液=7︰6的比例自行配制显色剂，需多少配多少(按比例配制显色剂时要防止磷污染，最好用专用吸嘴)。
- 试剂五乙液在冬天或4℃长时间保存时可能会出现凝胶状物质，37℃溶解不了，可将其60℃左右水浴10分钟即可完全溶解；甲液、乙液应防止磷污染。
- 组织的前处理：
准确称取组织重量，按重量(g):体积(mL)=1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，2500转/分，离心10分钟，取上清液(即10%的匀浆上清液)，再用生理盐水10倍稀释成1%，同时用考马斯亮蓝试剂测定组织蛋白。如果预试结果太高，再将1%的组织匀浆稀释成不同浓度再进行预试后再决定取样浓度。 - 培养细胞的前处理：
将培养细胞消化，离心，弃上清，留下层细胞，每管加0.2～0.3mL生理盐水或匀浆介质制备成107/cm3细胞悬液，即107/mL，再进行破碎。破碎细胞的方法有三种：
①、用匀浆器匀浆。
②、用超声粉碎器粉碎。
③、反复冻溶3次(第③种方法有时会影响酶活力)。
制备好的细胞悬液不需要离心，同时用考马斯亮兰试剂测定组织蛋白。再将细胞匀浆液稀释成不同浓度进行预试，根据预试结果决定取样浓度。
注1：在测试加样前要摇匀后取样。
注2：不可用磷酸盐缓冲液或含磷的试剂作为样本匀浆或稀释样本。
注3：预试结果将绝对吸光度值(测定管吸光度值—对照管吸光度值)控制在0.2左右为宜。
- 酶促反应：
成分 对照管 Na+k+—ATPase
测定管Ca2+Mg2+—ATPase
测定管双蒸水(mL) 0.16 0.12 样本(mL) 0.1 0.1 试剂八(mL) 0.08 试剂九(mL) 0.08 试剂十(mL) 0.04 试剂一(mL) 0.26 0.26 0.26 试剂二(mL) 0.08 0.08 0.08 试剂三(mL) 0.08 0.08 0.08 混匀，37℃准确反应10分钟 试剂四(mL) 0.1 0.1 0.1 样本(mL) 0.1 充分混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清定磷 - 定磷反应：
成分 空白管 标准管 对照管 Na+k+—ATPase
测定管Ca2+Mg2+—ATPase
测定管双蒸水(mL) 0.3 0.02μmol/mL磷标准液(mL) 0.3 上清液(mL) 0.3 0.3 0.3 显色剂(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 充分混匀后室温静置2分钟 试剂六(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀，室温静置5分钟，在636nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。
注：在比色前，将比色皿用自来水冲洗10余次，再用双蒸水冲洗4～5次，以免磷污染。
如果你的样本数量很多可以采用简便操作法：
- 酶促反应：
成分 对照管 Na+k+—ATPase
测定管Ca2+Mg2+—ATPase
测定管双蒸水(mL) 0.16 0.12 样本(mL) 0.1 0.1 试剂八(mL) 0.08 试剂九(mL) 0.08 试剂十(mL) 0.04 基质液(mL) 0.42 0.42 0.42 试剂二(mL) 0.08 0.08 0.08 试剂三(mL) 0.08 0.08 0.08 混匀，37℃准确反应10分钟 试剂四(mL) 0.1 0.1 0.1 样本(mL) 0.1 充分混匀，3500转/分，离心10分钟，取上清定磷。 - 定磷反应：
注：在比色前，将比色皿用自来水冲洗10余次，再用双蒸水冲洗4～5次，以免磷污染。成分 空白管 标准管 对照管 Na+k+—ATPase
测定管Ca2+Mg2+—ATPase
测定管双蒸水(mL) 0.3 0.02μmol/mL磷标准液(mL) 0.3 上清液(mL) 0.3 0.3 0.3 显色剂(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 充分混匀后室温静置2分钟 试剂六(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 混匀，室温静置5分钟，在636nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度值。
- 单位定义：
规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。即微摩尔磷/毫克蛋白/小时(μmolPi/mgprot/hour)。 - 计算公式：
组织中ATPase活力
(U/mgprot)＝ OD测定－OD对照 × 标准品浓度
(0.02μmol/mL)×6×7.8÷ 待测样本蛋白浓度
(mgprot/mL)OD标准－OD空白
注1：×6是因为定义是每小时，试剂操作10分钟，所以需乘6。
注2：×7.8是因为反应体系7.8倍稀释。 - 计算举例：
取0.1%的小鼠肝组织匀浆，按步骤操作，测得空白管吸光度值为0.052，标准管吸光度值为0.255，对照管吸光度值为0.280，测得Na+k+—ATPase管吸光度值为0.378，Ca2+Mg2+—ATPase管吸光度为0.460。同时测得1%的小鼠肝组织匀浆蛋白含量为0.998mgprot/mL。则计算如下：组织中Na+k+－ATPase
活力(U/mgprot)＝ OD测定－OD对照 × 标准品浓度
(0.02μmol/mL)×6×7.8÷ 待测样本蛋白浓度
(mgprot/mL)OD标准－OD空白 ＝ 0.378－0.280 ×0.02×6×7.8÷(0.998÷10)＝4.528U/mgprot 0.255－0.052 组织中Ca2+Mg2+－ATPase
活力(U/mgprot)＝ OD测定－OD对照 × 标准品浓度
(0.02μmol/mL)×6×7.8÷ 待测样本蛋白浓度
(mgprot/mL)OD标准－OD空白 ＝ 0.460－0.280 ×0.02×6×7.8÷(0.998÷10)＝8.316U/mgprot 0.255－0.052
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